A systematic proximity ligation approach to studying protein-substrate specificity identifies the substrate spectrum of the Ssh1 translocon

Nir Cohen, Naama Aviram, and Maya Schuldiner

EMBO Journal 2023 Vol. 42 e113385

(https://doi.org/10.15252/embj.2022113385)

タンパク質間の相互作用を見出す手法の一つにProximity labeling、近接依存性標識法と呼ばれる手法がある。

相互作用を調べたいタンパク質Ａにビオチン転移酵素やアスコルビン酸パーオキシダーゼを付加した融合タンパク質を細胞内で発現させておくことで、融合タンパク質と相互作用したタンパク質Ｂに酵素活性の作用でビオチンが転移されることがこの手法のキモとなる。

融合した酵素活性の違いで、BioID法とAPEX法と呼ばれる近接依存性標識法が開発されている。

これらの手法では、相互作用相手のタンパク質が標識される効率が発現量や相互作用の長さに依存しており、稀なタンパク質や一過的な相互作用を示すタンパク質を検出しにくいという問題点がる。

すなわち、関係のないタンパク質が標識されるバックグラウンドが無視できないことに加え、発現量が多くて強固な相互作用を示すタンパク質ほど強く標識される傾向があり、逆に発現量が少なくて相互作用が一過的なタンパク質が標識されないこともある。

そこでこの論文では、発現量や相互作用の強さに影響されない検出法を酵母で確立し、その手法の有用性を検証したことを報告している。

まずはBirA*融合タンパク質の分解をオーキシン制御下で行わせる系を確立し、あるタイミングで一斉にビオチン転移が起きるようにして標識強度のブレを抑制することをしている。

また、通常では0.512 nMという低濃度のビオチン存在下で酵母を培養しておき、標識したいタイミングでビオチン濃度を30 nMに急上昇させることをしている。

筆者たちはここで確立した手法をCel-lctivと命名してselectiveと読ませようとしており、実際にSec61とSsh1でこの手法の有油性を検証することをやっている。